Le analisi per Brettanomyces: il temuto nemico del vino

Conta su piastra, terreni specifici, qPCR, citofluorimetria a flusso, biosensori, sonde a RNA… La ricerca procede veloce e sempre più metodiche di analisi sono studiate e messe a punto per il rilevamento di “Brettanomyces”.

Ma quale scegliere?

Spesso risultati e prezzi sono molto diversi tra loro, tante informazioni ma poche argomentazioni. Come riconoscere il metodo con il miglior rapporto costo/beneficio?

Oggi vi aiutiamo a capire meglio come funzionano le analisi tramite PCR Real-time e le compariamo con le analisi tradizionali.
Abbiamo infatti analizzato per voi le ultime pubblicazioni sulle analisi per il Brettanomyces.

Cosa è la Real-Time PCR?

E’ una metodica molecolare, che come tutte le altre si basa sulla ricerca del DNA del lievito Brettanomyces, ma ha un vantaggio in più: riesce a quantificarlo e a rapportarlo alla cellule presenti nel vino, fornendo così un risultato in UFC/mL.
E’ estremamente specifica ma piuttosto laboriosa!
Ad oggi esistono in commercio kit già pronti che semplificano molto l’analisi, alcuni anche adatti a cantine abbastanza strutturate, ma è comunque consigliato/quasi obbligatorio che l’operatore sia una persona specializzata ed istruita nel campo!
Tutti i kit che si basano su Real Time PCR e sono stati adottati da molti laboratori enologici privati e /o di ricerca, ma non esistono in letteratura report scientifici sull’ efficacia e sulla performance di questi kit.

Abbiamo letto, studiato e analizzato uno degli articoli più recenti per voi.

Chi lo ha pubblicato?

Un gruppo di ricercatori francesi ha pubblicato nel 2016 un lavoro sul lievito Brettanomyces su OENO One, un giornale open access di IVES: ’the International Viticulture and Enology Society (IVES), un’associazione accademica dedicata alla viticultura e all’enologia, che ha lo scopo di offrire strumenti scientifici a ricercatori e specialisti del settore.

Cosa ci dice?

Sono stati valutati tre diversi kit commerciali basati su qPCR per la detection del Brettanomyces (Longin et al.).

Come hanno svolto gli esperimenti?

Per questo scopo sono stati coinvolti tre laboratori francesi specializzati in analisi enologiche (VAlMiS lab, Dijon; Microflora-ISVV lab, Bordeaux; Inther-Rhone lab, Orange), i quali hanno seguito i scrupolosamente i protocolli dei kit, così da generare dati comparabili. Tre diversi vini originari rispettivamente da Bordeaux, CotesduRhoneand Burgundy, inoculati con Brettanomyces bruxellensis a quattro diverse concentrazioni (102, 103, 104, 105 cellule/mL) sono stati usati per le analisi, insieme ad cinque vini contaminati naturalmente e provenienti da varie regioni francesi.I tre KIT basati su qPCR sono stati comparati ad un metodo di conta tradizionale su piastra, su piastra su terreno selettivo ITV (Gerbaux et al., 2000). I risultati ottenuti in merito alla presenza di Brettanomyces sono stati poi comparati con un metodo statistico.

Cosa hanno stabilito?

Il gruppo ha trovato molte difficoltà nella comparazione dei dati:

  • Non ha potuto stabilire una correlazione tra la concentrazioni di lievito ottenute dalle due metodiche per via dell’inaccettabilità statistica dei dati: la deviazione standard ha mostrato irriproducibilità dei dati e la bias (differenza tra il livello determinato tramite qPCR di Brettanomyces ed il metodo reference) si è rivelata estremamente variabile.
  • Nessun kit ha precisamente quantificato Brettanomyces, mostrando valori diversi in ogni replica, e fornendo spesso una sottostima, quando comparati col metodo in piastra. Questi dati evidenziano mancanza di precisione in queste analisi e il rischio di ottenere falsi negativi.

Ma siamo proprio sicuri? Dopo due settimane ci hanno riprovato…

 Le analisi sono state condotte sugli stessi vini due settimane dopo avere effettuato una solfitazione ( circa 2 mg/L mSO2).

  • In piastra nessuno dei vini ha mostrato la presenza di cellule vive;
  • La quantificazione tramite qPCR ha mostrato un certo livello di popolazione, in parte dovuto a cellule nello stato VBNC, in parte alla detection di cellule morte.

Perciò cosa possiamo concludere?

 Le analisi che hanno coinvolto i vini naturalmente contaminati da Brettanomyces hanno confermato i risultati precedenti:

  • C’è poca correlazione tra i risultati di cell/mL ottenuti;
  • Tutti e tre i diversi kit hanno determinato una sottostima della contaminazione rilevata invece attraverso conta su piastra;
  • Non è stato possibile validare nessuno dei tre kit, in quanto il livello di Brettanomyces detectato era sempre sopra o sottostimato e la differenza di valore rispetto al metodo in piastra (bias) troppo elevata per essere scientificamente accettata.
  • Lo stesso risultato prodotto da uno specifico kit su un dato vino ha mostrato altissima variabilità nelle repliche altalenando situazioni di sovrastima ad altre di sottostima.

Questi risultati evidenziano una scarsa capacità di quantificazione da parte dei tre kit commerciali, sebbene gli esperimenti siano stati condotti da laboratori specializzati nel settore enologico e nell’utilizzo di metodiche qPCR.
Al contrario il metodo basato su conta su piastra si è rivelato ancora una volta IL PIÙ AFFIDABILE.

SCEGLI BENE IL METODO CON CUI FARE LE ANALISI, CERCA IL GIUSTO BILANCIO TRA TEMPISTICHE, SOLDI E RISULTATI!

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A cura di Simona Campolongo

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