Resistenza all’anidride solforosa

Per prevenire contaminazioni e deterioramenti del vino dovuti alla presenza di Brettanomyces bruxellensis vengono generalmente usati diversi trattamenti. Tra questi possiamo trovare dei trattamenti fisici, come filtrazione a membrana o pastorizzazione flash, o chimici come aggiunta di chitosano e solfitazione (aggiunta di anidride solforosa). Quest’ultima è di solito l’arma più usata dai produttori di vino per prevenire la crescita di B. bruxellensis.

 

Solfitazione, siamo sicuri che funzioni veramente?

L’efficacia della solfitazione è difficile da valutare perché B. bruxellensis è piuttosto tollerante ai solfiti[1]. La tolleranza all’anidride solforosa (SO2) è dipendente dal ceppo che, secondo diversi studi, può variare fino a cinque volte da ceppo a ceppo[1], [2]. Concentrazioni da 0,2 a 0,5 mg/L di mSO2 (SO2 attiva) tipicamente inibiscono la crescita di questi contaminanti nei vini ma studi recenti hanno sottolineato che diversi ceppi di B. bruxellensis resistono a livelli molecolari di solfito molto diversi (0,2-1,1 mg/L mSO2).

Tuttavia, i solfiti sono stati segnalati per indurre uno stato Viable But Non-Culturable (VBNC) nelle cellule di B. bruxellensis[2], [3]. Queste cellule non sono sempre rilevabili dal conteggio delle cellule vitali nelle piastre ma possono portare a una nuova contaminazione quando la quantità di solfiti decrescerà nel tempo.

anidride solforosa

 

Come fa Brettanomyces a resistere?

Si definiscetolleranza la capacità dell’organismo di sopravvivere sotto l’azione di un agente inibitore, mentre con il termine resistenza” si indica la capacità di proliferare attivamente anche in presenza di antibiotici e questa si misura come concentrazione minima inibitoria (MIC).

La peculiarità dell’applicazione dell’anidride solforosa, tuttavia, è che la frazione antimicrobica attiva (mSO2) di questo agente dipende da parametri ambientali (come la temperatura, il contenuto di alcool e il pH) e che la frazione attiva diminuisce nel tempo grazie alla combinazione della SO2 libera.

In vinificazione, i livelli di solfiti vengono regolarmente riaggiustati in diversi step produttivi, creando così una stagionalità nella gestione dell’anidride solforosa durante il processo di vinificazione. In queste condizioni, l’effettiva sopravvivenza di B. bruxellensis nel vino potrebbe essere correlata a:

  • una sopravvivenza e conseguente crescita dopo l’iniziale trattamento con l’SO2 (meccanismo di resistenza);
  • una tolleranza al trattamento con SO2 fino ad una fase in cui la concentrazione di mSO2 è più bassa nel mezzo, seguita da una ripresa della crescita.

Di solito nel ramo della microbiologia clinica, si suggerisce che i ceppi tolleranti e quelli resistenti devono essere trattati in modo diverso. Se volessimo applicare questo concetto all’enologia i resistenti dovrebbero essere trattati con dosi più elevate per un tempo più breve, mentre quelli tolleranti dovrebbero essere debellati con dosi più basse ma con una durata più estesa del trattamento.

L’analisi dei profili di crescita di ceppi resistenti e tolleranti suggerisce che i ceppi di B. bruxellensis hanno sviluppato non una, ma molteplici strategie per far fronte alla SO2 presente nel vino.

Di quali strategie stiamo parlando?

Diversi studi hanno evidenziato una resistenza genotipo-dipendente all’anidride solforosa. In questi, data l’alta diversità genetica intra-specie, sono stati isolati numerosi ceppi e analizzati con marcatori microsatellitari e la tecnica AFLP, al fine di confermare il legame tra genotipo e la tolleranza alla SO2[4].

La resistenza all’anidride solforosa è stata ampiamente studiata in Saccharomyces cerevisiae. I principali meccanismi molecolari chiariscono questo fenotipo attraverso l’utilizzo della pompa di efflusso attiva Ssu1p. È stato dimostrato che l’allele SSU1-R, che è l’allele per la produzione della pompa di efflusso per la resistenza alla SO2, è nato durante l’evoluzione adattativa di S. cerevisiae[5]. Questa evoluzione ha permesso di accorciare la fase lag della curva di crescita di S. cerevisiae in presenza di SO2, conferendo così un relativo vantaggio selettivo rispetto ad altri ceppi.

Il ridotto effetto della SO2 sulla fase lag dei ceppi resistenti di B. bruxellensis potrebbe essere collegato a meccanismi simili. Infatti, l’allele specifico per l’espressione della pompa di efflusso BbSSU1 è stato rilevato per comparazione trascrittomica dei genomi dei due lieviti.

Nel 2016, Longin e colleghi, utilizzando una colorazione con ioduro di propidio e rilevazione mediante citometria a flusso, hanno mostrato che i solfiti inducono un aumento della permeabilità nelle cellule di lievito che, probabilmente, porta alla morte cellulare[6]. La capacità delle cellule per ripristinare la permeabilità funzionale potrebbe costituire un altro meccanismo di adattamento ai solfiti per B. bruxellensis. La molecola di SO2, infatti, ha vari effetti sulla struttura cellulare, sul metabolismo e sul genoma, sulla struttura specifica della membrana, ecc, in risposta all’anidride solforosa stessa.

Altri autori, inoltre, suggeriscono che alla base della resistenza di B. bruxellensis alla solforosa possa esserci anche un meccanismo di produzione di biofilm, che consente a tale microrganismo di produrre una matrice extracellulare (EPS) e difendersi così da agenti esterni come la SO2[7].

Come ci si deve comportare in cantina?

In sintesi, dopo lo stress dovuto alla solfitazione, le cellule di B. bruxellensis esistono in diversi stati fisiologici. A seconda del ceppo avremo cellule vitali e coltivabili, VBNC e/o cellule morte.

L’esistenza di cellule VBNC indotte dalla SO2 nel vino rosso mostra la necessità di valutare il livello di cellule in tale stato nel vino utilizzando tecniche adatte. Inoltre è bene mantenere un certo livello di mSO2 durante le fasi di invecchiamento per prevenire l’uscita di Brettanomyces da VBNC.

Facendo così gli enologi potranno ridurre il livello di solfito nel vino, a condizione che B. bruxellensis sia monitorato nel tempo.

Per il monitoraggio, gli enologi possono affidarsi al nostro Self-Brett®, che grazie alla sua capacità di rilevare il Brettanomyces anche a basse concentrazioni, permette di rilevare la presenza di tale lievito in tutte le fasi della vinificazione.

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[1]         A. Barata, J. Caldeira, R. Botelheiro, D. Pagliara, M. Malfeito-Ferreira, and V. Loureiro, “Survival patterns of Dekkera bruxellensis in wines and inhibitory effect of sulphur dioxide,” Int. J. Food Microbiol., 2008.

[2]         M. Agnolucci et al., “Sulphur dioxide affects culturability and volatile phenol production by Brettanomyces/Dekkera bruxellensis,” Int. J. Food Microbiol., 2010.

[3]         V. Serpaggi, F. Remize, G. Recorbet, E. Gaudot-Dumas, A. Sequeira-Le Grand, and H. Alexandre, “Characterization of the ‘ viable but nonculturable’ (VBNC) state in the wine spoilage yeast Brettanomyces,” Food Microbiol., 2012.

[4]         M. Avramova, A. Vallet-Courbin, J. Maupeu, I. Masneuf-Pomarède, and W. Albertin, “Molecular diagnosis of Brettanomyces bruxellensis’ sulfur dioxide sensitivity through genotype specific method,” Front. Microbiol., 2018.

[5]         J. E. Pérez-Ortín, A. Querol, S. Puig, and E. Barrio, “Molecular characterization of a chromosomal rearrangement involved in the adaptie evolution of yeast strains,” Genome Res., 2002.

[6]         C. Longin, C. Degueurce, F. Julliat, M. Guilloux-Benatier, S. Rousseaux, and H. Alexandre, “Efficiency of population-dependent sulfite against Brettanomyces bruxellensis in red wine,” Food Res. Int., 2016.

[7]         M. Lebleux et al., “New advances on the Brettanomyces bruxellensis biofilm mode of life,” Int. J. Food Microbiol., 2020.

 

1 thought on “Resistenza all’anidride solforosa

  1. […] concentrazioni di ossigeno e conservanti alimentari [4]. Recenti studi hanno indicato che l’anidride solforosa (SO2) – un agente antimicrobico usato nella conservazione delle bevande fermentate come il […]

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