il chitosano agisce sul Brettanomyces

Chitosano: il principale alleato contro il Brettanomyces

L’utilizzo del chitosano nei vini risulta essere una strategia vincente contro il Brettanomyces.

Ad oggi l’Anidride Solforosa viene utilizzata come metodo principale per limitare o eliminare l’azione del Brettanomyces bruxellensis sui vini. Tuttavia i solfiti possono talvolta causare reazioni allergiche (Vally & Thompson, 2001) e inoltre l’efficacia contro il Brettanomyces spp. non è assicurata in quanto la SO2 può indurre il lievito in uno stato VBNC (ne abbiamo parlato qui).

Per questi motivi risulta necessario esplorare strategie alternative per contrastare le contaminazioni da Brettanomyces!

Cos’è il chitosano?

Il chitosano è un polisaccaride idrofilo derivato dalla chitina, un polisaccaride di origine animale che si può trovare abbondantemente in natura. La chitina è caratterizzata da una struttura fibrosa ed è il principale costituente dello scheletro esterno di insetti e crostacei, come gamberetti, granchi e aragoste. Il chitosano viene ottenuto tramite deacetilazione della chitina, generalmente estratta dall’esoscheletro di crostacei (granchi, gamberi, ecc.) con una soluzione acquosa basica. Questo è il motivo per cui esistono vari tipi di chitosano in commercio che differiscono per:

  • origine (funghi, insetti, crostacei);
  • grado di deacetilazione;
  • peso molecolare;
La chitina è il principale costituente dello scheletro esterno di insetti e crostacei
La chitina è il principale costituente dello scheletro esterno di insetti e crostacei

Il chitosano presenta un ampio spettro antimicrobico a cui batteri gram-negativi e gram-positivi e funghi sono altamente sensibili.

Questo polisaccaride è considerato un materiale biofunzionale, ben tollerato dai tessuti viventi e commestibile, perciò particolarmente applicabile come rivestimento per prolungare la shelf-life dei prodotti e preservare la qualità degli alimenti freschi (Goy et al., 2009). In campo medico sono stati testati film di chitosano come medicazione curativa delle ferite e come impalcature per tessuti e ingegneria ossea (Barbosa et al., 2018).

Struttura chimica del chitosano
Struttura chimica del chitosano

Il gruppo reattivo funzionale presente nel chitosano (gruppo amminico in posizione C2 di ciascuna unità deacetilata e gruppi idrossilici al C6 e posizioni C3) può essere soggetto a derivatizzazione chimica, favorendo così la manipolazione delle proprietà meccaniche e solubili (ASSIS et al., 2009) e aumentandone la biocompatibilità.

 

L’azione antimicrobica contro il Brettanomyces

La chitina e il chitosano sono stati studiati come agenti antimicrobici in diversi organismi, tra cui alghe, funghi, lieviti e batteri.

Ma quali sono i lavori pubblicati in letteratura con i risultati più rilevanti sul chitosano?

  • Gómez-Rivas e colleghi (Gómez-Rivas et al., 2004) hanno studiato l’azione antimicrobica del chitosano su Saccharomyces cerevisiae, Brettanomyces intermedius e Brettanomyce bruxellensis. Dai loro studi, questi autori hanno osservato che l’aggiunta di alte concentrazioni di chitosano (da 300 a 600 g / hL) hanno portato all’inibizione di B. bruxellensis in un mezzo di coltura mentre S. cerevisiae non è stato influenzato.
  • Ferreira et al. (2013) hanno invece dimostrato che il chitosano può influire sul lievito in concentrazioni comprese tra 30 e 32,5 g / hL. Per questo motivo utilizzare il chitosano contro il Brettanomyces risulta essere la soluzione vincente.
  • Sempre gli stessi autori hanno studiato il chitosano di diversi pesi molecolari (da 107 a 621 kDa) concludendo che le preparazioni a basso peso molecolare sono più efficaci, con uno dei ceppi di B. bruxellensis studiati che mostra una riduzione di ben quattro logaritmi nella popolazione.
  • Park et al. (2008) hanno tuttavia osservato che i pesi molecolari più grandi dei preparati studiati (da 1 a 10 kDa) mostrano capacità di disturbo della membrana più forti, contro vari lieviti diversi però dal nostro non amato Brettanomyces bruxellensis. 
  • Nardi et al. (2014) hanno suggerito che il chitosano può consentire un controllo >9 mesi quando sono presenti popolazioni iniziali basse di Brettanomyces (<1000 cfu/mL). Tuttavia, Ferreira et al. (2013) e Taillandier et al. (2015) hanno osservato eventuali aumenti della coltivabilità del lievito anche dopo il trattamento con chitosano.
  • Taillandier et al. (2015) raccomandano infatti un travaso dei vini dopo qualche giorno di contatto con il chitosano per evitare il recupero delle cellule.

Ma perché i laboratori ottengono risultati contrastanti? Un recente articolo del 2016 prova a spiegarcelo:

I ricercatori del gruppo di Petrova hanno impostato un bel lavoro, pubblicato sulla rivista  Journal international des sciences de la vigne et du vin, provando a spiegarci il perché di queste differenze così sostanziali, che possono tradursi in un ingente spreco di soldi nel caso di utilizzo di alte concentrazioni di chitosano non necessarie. L’obiettivo di questa ricerca è infatti proprio quella di valutare e confrontare l’efficacia delle forme fungine, del guscio di granchio e delle forme complessate con lattati di chitosano, contro B. bruxellensis sia nei mezzi di coltura che nel vino rosso.

I ricercatori hanno mostrato che l’efficienza di questo trattamento dipende da numerosi fattori come il mezzo di coltura, la gradazione alcolemica, il ceppo di Brettanomyces bruxellensis utilizzato, ed il pH. Negli esperimenti condotti utilizzando come base il terreno di coltura (inteso come un liquido sintetico preparato in laboratorio) è stata evidenziata una migliore performance del chitosano di guscio di granchio e delle forme complessate con lattati di chitosano, rispetto al chitosano fungino. Inoltre, nel medesimo terreno di coltura, è stata riscontrata una migliore attività inibitoria a pH più acidi e a concentrazioni di etanolo maggioro. I ricercatori hanno poi analizzato l’azione dei composti in esame utilizzando vini Merlot e Cabernet-Sauvignon come substrati di crescita.

In questa seconda parte degli esperimenti non sono state riscontrate particolari differenze tra i chitosani utilizzati ma l’azione biocida è influenzata dalla concentrazione di chitosano aggiunta e dal tempo di trattamento. Gli autori hanno infatti concluso che, mentre le popolazioni coltivabili inizialmente diminuiscono fino a raggiungere bassi livelli dopo il trattamento con chitosano, tutti i ceppi testati sono in grado poi di ricrescere fino a popolazioni di 10˙000 CFU/mL.

Il chitosano è in grado di ridurre, ma non necessariamente eliminare, la popolazione di Brettanomyces dai vini stoccati in botte.

Per ulteriori approfondimenti è possibile leggere l’articolo, qui.

Come agisce il chitosano sul Brettanomyces?

Il chitosano interagisce con le pareti/membrane delle cellule e innesca varie risposte da parte di quest’ultima allo stress [(Rabea et al., 2003); (Liu et al., 2004); (Zakrzewska et al., 2005); (Park et al., 2008)].

  • Zakrzewska e colleghi (2005) hanno notato che l’applicazione del chitosano su S. cerevisiae aumenta la resistenza cellulare a β-1,3-glucanasi, caratteristica risposta allo stress della parete cellulare.
  • Un recente lavoro di Taillandier et al. (2015) ha concluso che questi risultati sono dovuti a un’azione antimicrobica scatenata contro B. bruxellensis a seguito di una serie di meccanismi tra cui l’aggregazione cellulare e la fuoriuscita di alcuni componenti.
Cellule di Brettanomyces prima e dopo l'utilizzo del chitosano
Cellule di Brettanomyces prima e dopo l’utilizzo del chitosano

Nel lavoro di Petrova è stato dimostrato (come si può vedere in figura) che la morfologia delle cellule di lievito coltivate in botti di rovere riempite con vino rosso è alterata dal trattamento con chitosano fungino. Anche se la larghezza/lunghezza delle cellule è rimasta simile prima o dopo il trattamento, le cellule hanno sviluppato numerosi noduli piccoli non presenti nei vini non trattati.

Posso usare il chitosano contro il Brettanomyces?

Come sottolineato da Kong et al., (2010), il chitosano è un polisaccaride non tossico e biodegradabile e  può perciò essere utilizzato negli alimenti, nell’industria farmaceutica, in agricoltura, nell’industria tessile, nel trattamento delle acque e nell’industria cosmetica.

Recentemente L’Europa, e in particolare l’Organizzazione Internationale de la Vigne et du Vin (O.I.V.), ha approvato l’utilizzo del chitosano di origine fungina nei vini. Il chitosano è utile nella chiarifica del mosto e del vino (Chagas et al., 2012), può rimuovere metalli pesanti o ocratossina A (Bornet & Teissedre, 2008) e può ridurre le popolazioni di microrganismi indesiderabili tra cui, di particolare interesse per il settore enologico, Brettanomyces bruxellensis [(Gómez-Rivas et al., 2004); (Ferreira et al., 2013); (Nardi et al., 2014); (Taillandier et al., 2015)].

Grape consiglia perciò di utilizzare il chitosano su partite di vino contaminate da Brettanomyces. È possibile acquistarlo acquistarlo insieme a Self-Brett direttamente da alcuni dei nostri rivenditori, tra cui:

 

Bibliografia

Agnolucci, M., Rea, F., Sbrana, C., Cristani, C., Fracassetti, D., Tirelli, A., & Nuti, M. (2010). Sulphur dioxide affects culturability and volatile phenol production by Brettanomyces/Dekkera bruxellensis. International Journal of Food Microbiology, 143(1–2), 76–80. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.07.022

ASSIS, O. B. G., BRITTO, D. DE, & FORATO, L. A. (2009). O Uso de Biopolímeros como Revestimentos Comestíveis Protetores Para Conservação de Frutas in natura e minimamente processadas. Embrapa Instrumentação Agropecuária. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 29(1), 1–24. www.cnpdia.embrapa.br/publicacoes/download.php?file=BPD29_2009.pdf

Barata, A., Caldeira, J., Botelheiro, R., Pagliara, D., Malfeito-Ferreira, M., & Loureiro, V. (2008). Survival patterns of Dekkera bruxellensis in wines and inhibitory effect of sulphur dioxide. International Journal of Food Microbiology, 121(2), 201–207. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2007.11.020

Barbosa, R. G., Trigo, M., Prego, R., Fett, R., & Aubourg, S. P. (2018). The chemical composition of different edible locations (central and edge muscles) of flat fish (Lepidorhombus whiffiagonis). International Journal of Food Science and Technology, 53(2), 271–281. https://doi.org/10.1111/ijfs.13583

Bornet, A., & Teissedre, P. L. (2008). Chitosan, chitin-glucan and chitin effects on minerals (iron, lead, cadmium) and organic (ochratoxin A) contaminants in wines. European Food Research and Technology, 226(4), 681–689. https://doi.org/10.1007/s00217-007-0577-0

Chagas, R., Monteiro, S., & Ferreira, R. B. (2012). Assessment of potential effects of common fining agents used for white wine protein stabilization. American Journal of Enology and Viticulture, 63(4), 574–578. https://doi.org/10.5344/ajev.2012.12016

Du Toit, W. J., Pretorius, I. S., & Lonvaud-Funel, A. (2005). The effect of sulphur dioxide and oxygen on the viability and culturability of a strain of Acetobacter pasteurianus and a strain of Brettanomyces bruxellensis isolated from wine. Journal of Applied Microbiology, 98(4), 862–871. https://doi.org/10.1111/j.1365-2672.2004.02549.x

Gómez-Rivas, L., Escudero-Abarca, B. I., Aguilar-Uscanga, M. G., Hayward-Jones, P. M., Mendoza, P., & Ramírez, M. (2004). Selective antimicrobial action of chitosan against spoilage yeasts in mixed culture fermentations. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 31(1), 16–22. https://doi.org/10.1007/s10295-004-0112-2

Goy, R. C., De Britto, D., & Assis, O. B. G. (2009). A review of the antimicrobial activity of chitosan. Polimeros, 19(3), 241–247. https://doi.org/10.1590/S0104-14282009000300013

Kong, M., Chen, X. G., Xing, K., & Park, H. J. (2010). Antimicrobial properties of chitosan and mode of action: A state of the art review. International Journal of Food Microbiology, 144(1), 51–63. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2010.09.012

Liu, H., Du, Y., Wang, X., & Sun, L. (2004). Chitosan kills bacteria through cell membrane damage. International Journal of Food Microbiology, 95(2), 147–155. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2004.01.022

Nardi, T., Vagnoli, P., Minacci, A., Gautier, S., & Sieczkowski, N. (2014). Evaluating the impact of a fungal-origin chitosan preparation on Brettanomyces bruxellensis in the context of wine aging. Wine Studies, 3(1), 13–15. https://doi.org/10.4081/ws.2014.4574

Park, Y., Kim, M. H., Park, S. C., Cheong, H., Jang, M. K., Nah, J. W., & Hahm, K. S. (2008). Investigation of the antifungal activity and mechanism of action of LMWS-chitosan. Journal of Microbiology and Biotechnology, 18(10), 1729–1734.

Rabea, E. I., Badawy, M. E. T., Stevens, C. V., Smagghe, G., & Steurbaut, W. (2003). Chitosan as antimicrobial agent: Applications and mode of action. Biomacromolecules, 4(6), 1457–1465. https://doi.org/10.1021/bm034130m

Taillandier, P., Joannis-Cassan, C., Jentzer, J. B., Gautier, S., Sieczkowski, N., Granes, D., & Brandam, C. (2015). Effect of a fungal chitosan preparation on Brettanomyces bruxellensis, a wine contaminant. Journal of Applied Microbiology, 118(1), 123–131. https://doi.org/10.1111/jam.12682

Vally, H., & Thompson, P. J. (2001). Role of sulfite additives in wine induced asthma: Single dose and cumulative dose studies. Thorax, 56(10), 763–769. https://doi.org/10.1136/thorax.56.10.763

Zakrzewska, A., Boorsma, A., Brul, S., Hellingwerf, K. J., & Klis, F. M. (2005). Transcriptional response of Saccharomyces cerevisiae to the plasma membrane-perturbing compound chitosan. Eukaryotic Cell, 4(4), 703–715. https://doi.org/10.1128/EC.4.4.703-715.2005

Zuehlke, J. M., & Edwards, C. G. (2013). Impact of sulfur dioxide and temperature on culturability and viability of brettanomyces bruxellensis in wine. Journal of Food Protection, 76(12), 2024–2030. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-13-243R

 

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